Протеиназ К mNGS (сыеклык)
Протеиназ К - киң субстрат үзенчәлеге булган тотрыклы серин протеазы.Туган дәүләттә хәтта юу чаралары булганда да күп протеиннарны киметә.Кристалл һәм молекуляр структура тикшеренүләреннән алынган дәлилләр ферментның субтилисиннар гаиләсенә керүен күрсәтә, актив сайт катализатор өчлеге (Asp)39- Аның69-Сер224).Чокырның төп мәйданы - алифатик һәм хуш исле аминокислоталарның карбоксил группасына кушылган пептид бәйләнеше.Бу гадәттә аның киң үзенчәлеге өчен кулланыла.Бу протеиназ K махсус mNGS өчен эшләнгән.К бүтән протеиназ белән чагыштырганда, ул шул ук энзиматик эш белән азрак нуклеин кислотасы белән пычрануны үз эченә ала, бу агымдагы mNGS кушымтасын яхшырак тәэмин итә ала.
Саклау шартлары
2-8 2 2 ел
Спецификация
| Күренеш | Төссез ачык куе сыеклык |
| Эшчәнлек | ≥800 U / мл |
| Протеин концентрациясе | ≥20 мг / мл |
| Никаз | Беркем дә табылмады |
| DNase | Беркем дә табылмады |
| RNase | Беркем дә табылмады |
Сыйфатлар
| EC саны | 3.4.21.64(Тритирахий альбомыннан рекомбинант) |
| Изоэлектрик нокта | 7.81 |
| Оптималь рН | 7.0- 12.0 Рәсем 1 |
| Оптималь температура | 65 2 2 нче рәсем |
| рН тотрыклылыгы | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 с) 3 нче рәсем |
| Rылылык тотрыклылыгы | 50 астыннан (pH 8.0, 30 мин) 4 нче рәсем |
| Саклау тотрыклылыгы | 12 ай эчендә 90% тан артык активлык 25 at |
| Активаторлар | SDS, карбамид |
| Ингибиторлар | Диисопропил флюорофосфат;фенилметилсульфонил фторид |
Кушымталар
1. Генетик диагностика комплекты
2. РНК һәм ДНК чыгару комплектлары
3. Протеин булмаган компонентларны тукымалардан чыгару, ДНК кебек протеин пычракларының деградациясевакциналар һәм гепарин әзерләү
4. Хромосома ДНКсын импульслы электрофорез белән әзерләү
5. Көнбатыш блот
6. Витро диагностикасында энзиматик гликозилатланган альбумин реагентлары
Саклык чаралары
Кулланганда яки үлчәгәндә саклагыч перчаткалар һәм күзлекләр киегез, кулланганнан соң яхшы җилләтеп торыгыз.Бу продукт тире аллергик реакциясенә һәм күзнең җитди ачуына китерергә мөмкин.Әгәр дә сулыш алса, бу аллергия яки астма симптомнары яки диспнея китерергә мөмкин.Сулыш алуда ачу китерергә мөмкин.
Берәмлекне билгеләү
Бер берәмлек (U) 1 ммол чыгару өчен казинаны гидролизлау өчен кирәк булган фермент күләме дип билгеләнәтүбәндәге шартларда минутына тиросин.
Реагентлар әзерләү
I реагенты: 1г сөт казинасы 50мл 0,1М натрий фосфат эремәсендә (pH 8.0) эретелгән, 65-70 ℃ суда 15 минутка инкубацияләнгән, кушылган һәм эретелгән, су белән суытылган, натрий гидроксиды pH 8.0 белән көйләнгән, һәм күләм күләме 100мл.
II реагент: 0,1М трихлороацетик кислотасы, 0,2М натрий асетат, 0,3М кислотасы.
III реагент: 0,4М На2CO3чишелеш.
IV реагент: Форинт реагенты чиста су белән 5 тапкыр эретелгән.
V реагенты: Фермент эретүче: 0,1М натрий фосфат эремәсе (pH 8.0).
VI реагент: тиросин эремәсе: 0, 0,005, 0.025, 0.05, 0.075, 0,1, 0,25 умол / мл тиросин 0,2 белән эретелгәнM HCl.
Процедура
1. 0,5мл реагент I 37 pre кадәр алдан җылытыла, 0,5мл фермент эремәсе кушыгыз, яхшылап кушыгыз һәм инкубацияләгез.37 10 10мин.
2. Реакцияне туктатыр өчен, яхшылап катнашыгыз һәм 30 минут дәвамында инкубацияне дәвам итәр өчен 1мл реагент II кушыгыз.
3. reactionентрифугат реакция чишелеше.
4. 0,5мл супернатант алыгыз, 2,5мл реагент III, 0,5мл реагент IV кушыгыз, яхшылап кушыгыз һәм 37 at тә инкубацияләгез.30мин.
5. ОД660ОД дип билгеләнде1;буш контроль төркем: ферментны алыштыру өчен 0,5мл реагент V кулланылаОДны билгеләү өчен чишелеш660ОД2, ΔOD = OD1-OD2.
6. Л.660L-тиросинның төрле концентрациясе өчен, аннары Y = kX + b стандарт кәкре алынган, монда Y - L-тиросин концентрациясе, X - OD600.
Хисаплау
2: Реакция эремәсенең гомуми күләме (мл)
0,5: Фермент эремәсе күләме (мл)
0,5: Хромоген билгеләүдә кулланылган реакция сыеклык күләме (мл)
10: Реакция вакыты (мин)
Df: Күп тапкыр эретү
C: Фермент концентрациясе (мг / мл)
Белешмәләр
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Рез.Коммун.(1971);44: 513.
3. Хилц, Х.һ.б.,EUR.Дж. Биохим.(1975);56: 103-108.
4. Самбрук Джet ал., Молекуляр клонлау: лаборатория кулланмасы, 2 нче басма, Салкын чишмә портыЛаборатория басмасы, Салкын Чишмә порты (1989).
Фигуралар
Инҗир.1 Оптималь pH
100мМ буфер эремәсе: pH6.0-8.0, На-фосфат;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Гликин-NaOH.Энзим концентрациясе: 1мг / мл
Рәсем.2 Оптималь температура
20 мм К-фосфат буфер pH 8.0 реакциясе.Фермент концентрациясе: 1 мг / мл
3 нче рН Тотрыклылык
25 ℃, 50 мм буфер эремәсе белән 16 с-эшкәртү: pH 4.5- 5.5, Ацетат;pH 6.0-8.0, На-фосфат;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Гликин-NaOH.Фермент концентрациясе: 1 мг / мл
4 нче рәсем тотрыклылык
50 мм Tris-HCl буферы белән 30 мин-эшкәртү, pH 8.0.Фермент концентрациясе: 1 мг / мл
5 нче рәсем стабилиty at 25 ℃
