RTL кире транскрипт
RTL кире транскриптаз - 3 '→ 5' экзонуклаз активлыгы булмаган һәм RNase H активлыгы булган РНК шаблонына бәйле ДНК полимерасы.Бу фермент РНКны шаблон буларак куллана ала, ДНКның тулы полосасын синтезлау өчен, бу беренче катлы CDNA синтезына кулланылырга мөмкин, аеруча RT-LAMP (цикллы арадаш изотермаль көчәйтү).RTL кире транскриптаз 1.0 белән чагыштырганда, сизгерлек сизелерлек яхшыра, җылылык тотрыклылыгы көчлерәк, 65 ° C реакция тотрыклырак.Лиофилизацияләнгән препаратлар, лиофилизацияләнгән RT-LAMP реагентлары һ.б. әзерләү өчен RTL кире транскриптаз (глицеролсыз) кулланылырга мөмкин.
Берәмлек төшенчәсе
Бер агрегат 1 нмол dTTPны 20 минут эчендә 50 ° C температурада кислота-явым-төшемле материалга кертә, поли (A) • олиго (dT) 25 шаблон-праймер буларак.
Компонентлар
| Компонент | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Кире Транскриптаз (Глицеролсыз) (15U / μL) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| 10 × HC RTL Буфер | 1,5 мл | 4 × 1,5 мл | 5 × 10 мл |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 мл | 2 × 1,5 мл | 3 × 10 мл |
Саклау торышы
0 ° C астында транспорт һәм -25 ° C ~ -15 ° C сакланырга тиеш.
Сыйфат белән идарә итү
- Калдык эшчәнлегеEndonuclease:1 μг λDNA һәм 15 берәмлек RTL2.0 булган 50 μL реакция, 16 сәгатьтә 37 at инкубацияләнгән, гель электрофорезы белән тискәре контроль кебек үрнәк күрсәтә.
- Калдык эшчәнлегеЭкзонуклаз:50 μL реакциядә 1 μг Хинд Ⅲ сеңдерелгән λDNA һәм 15 берәмлек RTL2.0 37 сәгатьтә 16 сәгать инкубацияләнгән, гел электрофорезы белән тискәре контроль кебек үрнәк күрсәтәләр.
- Калдык эшчәнлегеНиказ:50 μЛ реакциядә 1 μг суперкойлланган pBR322 һәм 15 берәмлек RTL2.0 37 ° C тәүлек эчендә инкубацияләнгән, гель электрофорезы белән тискәре контроль кебек үрнәк күрсәтәләр.
- Калдык эшчәнлегеRNase:10 μL реакциядә 0,48 μг MS2 RNA һәм 15 берәмлек RTL2.0 37 ° C тәүлек эчендә инкубацияләнгән, гель электрофорезы белән тискәре контроль кебек үрнәк күрсәтәләр.
- E. coli gДНК:Белән үлчәнәE.coliспециаль HCD ачыклау комплектлары RT 15 берәмлек RTL2.0 1дән кимE. coliгеном.
Реакция урнаштыру
cDNA синтез протоколы
| Компонентлар | Том |
| Шаблон РНК а | өстәмә |
| Олиго (dT) 18 ~ 25 (50уМ) яки очраклы пример катнашмасы (60уМ) | 2 μЛ |
| dNTP Микс (һәрберсе 10мМ) | 1 μЛ |
| RNase ингибиторы (40U / uL) | 0,5 μЛ |
| RTL Кире Транскриптаз 2.0 (15U / uL) | 0,5 μЛ |
| 10 × HC RTL Буфер | 2 μЛ |
| Нуклеизсыз су | 20 μЛ кадәр |
Искәрмәләр:
1) Тоталь РНКның тәкъдим ителгән дозасы 1ng ~ 1μg
2) mRNAның тәкъдим ителгән дозасы 50ng ~ 100ng иде
Термо-велосипедта көн тәртибе реакция ：
| Температура (° C) | Вакыт |
| 25 ° C.a | 5мин |
| 55 ° C. | 10минb |
| 80 ° C. | 10мин |
Искәрмәләр:
1) Әгәр очраклы Пример Микс кулланылса, 25 ° C инкубация адымы.
2) Әгәр максатлы пример катнашмасы кулланылса, 55 ~ C температурада 10 ~ 30мин.
RT-LAMP беркетмәсе
| Компонентлар | Том | Соңгы концентрация |
| Шаблон РНК | өстәмә | ≥10 данә |
| dNTP Микс (10мМ) | 3,5 μЛ | 1,4 мм |
| FIP / BIP Праймерлар (25 ×) | 1 μЛ | 1,6 μM |
| F3 / B3 Праймерлар (25 ×) | 1 μЛ | 0,2 ММ |
| LoopF / LoopB Праймерлары (25 ×) | 1 μЛ | 0,4 мм |
| RNase ингибиторы (40U / μL) | 0,5 μЛ | 20 U / реакция |
| RTL Кире Транскриптаз 2.0 (15U / μL) | 0,5 μЛ | 7.5 U / реакция |
| Bst V2 ДНК полимерасы (8U / μL) | 1 μЛ | 8 U / реакция |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 μЛ | 6 мм (барлыгы 8 мм) |
| 10 × HC RTL буферы (яки 10 × HC Bst V2 буферы) | 2,5 μЛ | 1 × (2мМ Mg2 +) |
| Нуклеизсыз су | 25 μЛ кадәр | - |
Искәрмәләр:
1) Вортексинг һәм центрифуга белән кыска вакыт эчендә җыярга.1 сәгать дәвамында 65 ° C даими температура инкубациясе.
2) Ике буфер үзара эш итә һәм бер үк композициягә ия.
Искәрмәләр
1.Бу продукт -20 ° C саклаганда ак каты формалашачак.Аны -20 ° C дан алып, 10 минут чамасы боз өстенә куегыз.Эрегәннән соң, аны селкетеп, катнаштырып кулланырга мөмкин.
2. CDNA продукты -20 ° C яки -80 ° C сакланырга яки PCR реакциясе өчен шунда ук кулланылырга мөмкин.
3. RNase пычрануына юл куймас өчен, зинһар, эксперимент мәйданын чиста тотыгыз, эш вакытында чиста перчаткалар һәм битлекләр киегез.
