ДНК чыгару мини комплекты
Бу комплект оптимальләштерелгән буфер системасын һәм кремний гел баганасын чистарту технологиясен куллана, алар TAE яки TBE агароза геленең төрле концентрацияләреннән 70 ат көченнән - 20 кб ДНК фрагментларын торгыза ала.ДНК adsorption баганасы югары тозлы шартларда махсус ДНКны үзләштерә ала.Моннан тыш, комплект ДНК фрагментларын PCR продуктларыннан, энзиматик реакция системаларыннан яки башка ысуллар белән алынган чиста ДНК продуктларыннан чистарта ала, һәм протеиннар, башка органик кушылмалар, органик булмаган тоз ионнары һәм олигонуклеотид примерлары кебек пычракларны бетерә ала.Бу чистарту 10-15 минут эчендә тәмамланырга мөмкин.Чистартылган ДНК турыдан-туры лигация, трансформация, фермент ашказаны, витро транскрипция, PCR, эзләү, микроинжекция һ.б. өчен кулланылырга мөмкин.
Саклау шартлары
-15 ~ -25 at саклагыз, бүлмә температурасында ташыгыз.
Компонентлар
| Компонентлар | (100 rxns) |
| Буфер тулаем продукт | 80 мл |
| Буфер GW | 2 × 20 мл |
| Elution Buffer | 20 мл |
| FastPure DNA мини баганалары-G | 100 |
Буфер тулаем продукт:ДНК бәйләүче буфер.
Буфер GW:Буфер юу;кулланганчы шешәдә күрсәтелгән күләм буенча абсолют этанол өстәргә.
Elution Buffer:Elution.
FastPure DNA мини баганалары-G:ДНК adsorption баганалары.
Коллекция трубалары 2 мл:Фильтрлау өчен коллекция трубалары.
Әзер материаллар
1,5 мл стерилизацияләнгән торбалар, абсолют этанол һәм изопропанол (ДНК фрагменты ≤100 б.п. булганда, 1 том өстәргә)
изопропанолдан 1 томга кадәр гель), су мунчасы.
Эксперимент процессы
Буфер GWны эретү өчен 80 мл этанол кушыгыз, куллану алдыннан тегендә күрсәтелгәнчә, бүлмә температурасында саклагыз.
Механизм
1. PCR реакция чишелеше
Гель чыгару схемасы: Тигез күләмдә Буфер ИДП PCR реакция чишелешен торгызу схемасы өстәгез:Буфер күләмен 5 тапкыр өстәгез
2. ИДП Гель күләмен исәпләгез (100 μl 100 мг тигез)
Гел эретегез
3. 50 ~ 55 тә җылыта℃
4. Washу
300 μЛ Бафер ИДП өстәргә *
700 μL Буфер GW өстәргә
700 μL Буфер GW өстәргә
5. Elute
20 - 30μL Elution Buffer яки дезонизацияләнгән су өстәргә
Искәрмәләр * PCR реакция сыеклыгын бу адымсыз торгызу
Гель чыгару программасы
1. ДНК фрагментларын бүлү өчен ДНК электрофорезыннан соң, UV нуры астында агароза геленнән ДНК фрагментының бер полосасын акцизлагыз.Гельнең күренгән дымын сеңдерү өчен, сеңдергеч кәгазь куллану һәм мөмкин кадәр өстәмә агарозаны чыгарып, гель кисәгенең күләмен киметү тәкъдим ителә.Аның күләмен исәпләү өчен гель кисәген үлчәгез (микроцентрифуга торбасыз): тыгызлыгы 1г / мл дип уйлап, 100 мг гельсисның күләме якынча 100 μЛ.
2. Тигез күләмдә Буфер ИДП өстәгез, 7 ~ 10 минутка 50 ~ 55 at инкубацияләгез (гель зурлыгына карап, гель тулысынча эреп беткәнче инкубация вакытын көйләгез).Трубаны инкубация вакытында 2 тапкыр әйләндерегез.
1-3 Буфер ИДПның 1-3 томын өстәү ДНКны торгызу эффективлыгына тәэсир итмәячәк.Әгәр дә ДНК фрагменты <100 б.п., 3 томлык Буфер ИДП өстәргә кирәк;гель кисәге тулысынча эреп беткәч, 1 том изопропанол кушыгыз һәм яхшылап кушыгыз, аннары киләсе адымга дәвам итегез.
3. rентрифуга кыска вакыт эчендә үрнәкне труба төбенә китерү, FastPure DNA Mini Columns-G Коллекция трубаларына 2 мл кертү, эремәне максималь рәвештә 700 μL максимум күчерү.
фильтрлау баганаларына вакыт, центрифуга 12,000 әйләнештә (13,800 Х г) 30-60 сек.
4. Фильтрны ташлагыз һәм баганага 300 μЛ Бафер ИДП кушыгыз, бүлмә температурасында 1 минут инкубацияләгез, центрифуга 12,000 әйләнештә (13,800 X г) 30-60 сек.
5. Фильтрны ташлагыз һәм баганага 700 μL буфер (абсолют этанол кушылганын тикшерегез!) Өстәгез, центрифуга 12,000 әйләнештә (13,800 X г) 30-60 сек.
Δ Зинһар, adsorption баганасы стенасы тирәсенә Буфер GW кушыгыз, яки Буфер GW арткы капкасын өстәгез һәм аны 2 - 3 тапкыр өскә кушыгыз, труба стенасына ябыштырылган тозны тулысынча агызырга ярдәм итегез.
6. 5 адымны кабатлагыз.
Buff Буфер GW белән ике тапкыр агызу тозның тулысынча чыгарылуын һәм алдагы экспериментларга йогынтысын бетерергә мөмкин.
7. Фильтрны ташлагыз һәм буш багананы 12000 әйләнештә (13,800 Х г) 2 минутка ташлагыз.
8. Колоннаны чиста 1,5 мл микроцентрифука трубасына кертегез, багана мембранасы үзәгенә 20 - 30 μL Elution Buffer кушыгыз, 2 минут инкубацияләгез, аннары центрифуга 12,000 әйләнештә (13,800 X г) 1 минутка.Колоннаны ташлагыз, алынган ДНКны -20 саклагыз.
8 8-нче адымның супернатантын баганага күчерү һәм Elution Буферын 55кә кадәр җылыту (ДНК фрагменты> 3 кб булганда), бәлки, торгызу эффективлыгын күтәрү өчен файдалы булыр.
PCR продуктларын торгызу программасы
Бу протокол ДНК фрагментларын PCR продуктларыннан, энзиматик реакция системасыннан һәм башка ДНК чимал продуктларыннан (генетик ДНКны да) чистарту өчен кулланыла.Бу чишелеш төрле нуклеотидларны, праймерларны, пример үлчәмнәрен, тоз молекулаларын, ферментларны һәм башка пычракларны эффектив рәвештә бетерә ала.
1. Кыска центрифуга PCR продуктлары, энзиматик реакция чишелеше һәм башка ДНК чимал продуктлары.Аларның күләмен пипетка белән бәяләгез һәм стерилизацияләнгән 1,5 мл яки 2 мл трубага күчерегез.100 μЛ күләменә кадәр ddH2O кушыгыз;югары концентрацияле геном ДНК өчен, 300 μL ddH2O белән эретү торгызу эффективлыгын күтәрергә ярдәм итәчәк.
2. Буфер ИДПның 5 томын өстәгез, инвертация яки вортексинг белән яхшылап кушыгыз.Әгәр дә ДНК процент фрагменты> 100 ат көче булса, өстәмә 1,5 том (үрнәкләр + Буфер ИДП) этанол өстәргә кирәк.
3. Колоннаны җыю трубасына кире кертегез, микструаны баганага күчерегез, центрифуга 12,000 әйләнештә (13,800 × г) 30 - 60 сек.Әгәр дә катнаш эремәнең күләме> 700 µЛ булса, адсорбция баганасын җыю трубасына салыгыз, калган чишелешне адсорбция баганасына күчерегез, һәм центрифуга 12,000 әйләнештә (13,800 × г) 30 - 60 сек.
4. Киләсе спектакль 08- 1 / Гель чыгару программасының 5 - 8 адымына карый.
Кушымталар
TAE яки TBE агароза геленең төрле концентрацияләре;PCR продуктлары, энзиматик реакция системалары яки төрле ысул белән алынган ДНК продуктлары.Кире кайтарылган фрагментлар70 бп -20 кб.
Искәрмәләр
Тикшеренү өчен генә кулланыгыз.Диагностик процедураларда куллану өчен түгел.
1. Буфер GW-ны эретү өчен 80 мл этанол кушыгыз, бүлмә температурасында саклагыз.
2. Әгәр түбән температураны саклау вакытында буфер тулаем продуктны яудыру җиңел булса, аны кулланганчы берникадәр вакыт бүлмә температурасында урнаштырырга мөмкин.Кирәк булса, аны 37 ℃ су мунчасында җылытырга мөмкин, явым-төшем тулысынча эреп беткәнче, аннары аны кушканнан соң кулланырга мөмкин.
3. Су мунчасы температурасын алдан 50 ~ 55 to итеп куегыз.
4. 08-1 / Гель чыгару программасының беренче адымында, гель кисәгенең күләмен киметү эретү вакытын сизелерлек киметәчәк һәм торгызу эффективлыгын арттырачак (Сызыклы ДНК югары температурада өзлексез гидролизга җиңел).ДНК гелен озак вакыт УВга кертмәгез, чөнки ультрафиолет нуры ДНК зарарына китерергә мөмкин.
5. Гельне 08- 1 / Гель чыгару программасының 2 адымында эрегез, югыйсә ДНКны торгызу эффективлыгы җитди йогынты ясар.
6. Элитация Буферы яки ddH2O - 55 алдыннан җылыту, бу ДНКның эффективлыгын күтәрү өчен файдалы.ДНКны 2,5 мм Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5 элюентында сакларга киңәш ителә.
