EndoFree Плазмид Макси комплекты

Саклау шартлары

RNaseA -30 ~ -15 at сакланырга һәм ≤0 at ташылырга тиеш.

Эндотоксин Скавенгерны бер айга 2 ~ 8 at сакларга, озак вакыт саклау өчен -30 ~ -15 at сакларга мөмкин.һәм ≤0 at ташыйлар.

Башка компонентлар бүлмә температурасында (15 ~ 25 ℃) сакланырга һәм бүлмә температурасында ташылырга тиеш.

Компонентлар

RNaseA:РНКны бетерү өчен кулланылган 10 мг / мл.

Буфер P1:бактерия асылмалы буфер, беренче кулланганчы буфер P1га RNaseA кушыгыз.

Буфер P2:бактерия лизис буферы (SDS / NaOH булган).

Буфер P4:нейтральләштерүче буфер.

Эндотоксин Скавенгер:Эндотоксинны чиста плазмид экстрактыннан эффектив рәвештә чыгарыгыз.

Буфер PW:буферны юыгыз, беренче кулланганчы этанолның күләмен өстәгез.

Буфер тубы:элитация буферы.

FastPure DNA Макси баганалары:плазмид ДНК adsorption баганалары.

Коллекция трубалары 50 мл:фильтр җыю трубалары.

Эндотоксинсыз коллекция трубасы:плазмид ДНК җыю трубалары.

Әзер материаллар

Абсолют этанол, изопропанол, 50 мл түгәрәк центрифуга торбалары һәм 50 мл эндотоксинсызцентрифуга торбалары.

Кушымталар

Бу продукт плазмидларны 150 - 300 мл бактерия эремәсеннән зур күләмдә чыгару өчен яраклытөнлә культуралы.

Эксперимент процессы

1. Төнлә культуралы һәм центрифугада 150 - 200 мл (300 млдан артмый) бактерия эремәсе алыгызякынча 11,000 әйләнеш (12,000 × г) 1 - 2 минут.Супернатантны ташлагыз һәм бактерияләр җыегыз.

50 50 млдан артык бактерия эремәсе җыйганда, бактерияләр бактерия эремәсе, центрифугация кушып, супернатантны ташлап һәм шул ук 50 мл трубада башка адымнарны җыеп җыелырга мөмкин.

берничә тапкыр.

2. centентрифуга 7,5 мл Буфер П1 кушыгыз (зинһар, RNaseA Буфер П1га кушылганын тикшерегез).бактерияләр булган труба һәм вортекс яки пипетинг белән яхшылап катнашыгыз.

This Бу адымда бактерияләрнең тулы реанимациясе уңыш бирү өчен бик мөһим, һәм реанимациядән соң бактерияләр тупланырга тиеш түгел.Әгәр дә яхшылап катнашмаган бактерия кисәкләре булса, ул лизиска тәэсир итәчәк, нәтиҗәдә аз уңыш һәм чисталык.Әгәр дә OD600 бактерия эремәсе 0,65 булса, 150 мл бактерия эремәсеннән 7,5 мл Буфер П1 кулланырга киңәш ителә;OD600 0,75 булганда, 8 мл буфер P1 кулланырга һәм буфер P2 һәм P4 күләмнәрен тиешенчә үзгәртергә кирәк.Әгәр бактерия эремәсе күләме 200 млга кадәр артса, бу киңәш ителәБуферлар P1, P2, һәм P4 пропорциональ рәвештә арттырыла.

3. 2-нче адымнан бактерия асылмасына 7,5 мл Буфер П2 кушыгыз һәм 6 - 8 өчен йомшак өскә-аста кушыгыз.вакыт һәм бүлмә температурасында 4 - 5 минут.

Thorough Яхшылап катнашырга әкрен генә әйләндерегез.Вортексинг геном ДНК фрагментына китерәчәк, нәтиҗәдә алынган плазмидта геном ДНК фрагментлары.Бу вакытта, эремә ябыштыргыч һәм тонык була, бактерияләрнең тулысынча лизланганын күрсәтә.Плазмидлар юкка чыкмасын өчен, озынлыгы 5 минуттан артмаска тиеш.Әгәр чишелеш ачык булмаса, бактерияләр бик күп булырга мөмкинтулы булмаган лизис, шуңа күрә бактерияләр күләме тиешенчә киметелергә тиеш.

4. 3 адымнан бактерия асылмасына 7,5 мл Буфер П4 кушыгыз һәм буфер P2 тулысынча нейтральләштерелсен өчен, шунда ук 6 - 8 тапкыр әкрен генә әйләндерегез.Бу вакытта ак флокулент явым-төшем барлыкка килергә тиеш.Centентрифуга якынча 11,000 әйләнештән (12,000 × г) 10-15 минут эчендә, супернатантны яңа 50 мл түгәрәк асты центрифуга трубасына кертегез, һәм сакланыгыз.йөзүче ак явым-төшемгә омтылыгыз.

P Буфер P4 кушыгыз һәм яхшылап кушылу өчен шунда ук кире әйләнегез.Ак явым-төшем эремә буенча тигез бүленгәнче торбаны калдырыгыз, нейтральләштерүгә тәэсир итә торган җирле явым-төшем җитештерүне булдырмас өчен.Centентрифугация алдыннан бертөрле ак флокулент явым-төшем булмаса һәм центрифугациядән соң супернатант ачык булмаса, труба булырга мөмкинтагын 5 минутка центрифуга.

5. Эндотоксин Скавенгерның күләмен 1 тапкыр (гадәттән тыш күләмнең 10%, якынча 2,2 мл) өстәргә, 4 адымнан супернатантка кушыгыз һәм кушылырга кире кайтыгыз.Чишелешне боз мунчасына урнаштырыгыз яки вакланган бозга (яки суыткыч туңдыргычка) 5 минут эчендә эретегез, турбидтан чиста һәм ачык булганчы (яки әле дә)бераз турбид), һәм вакыт-вакыт берничә тапкыр катнашыгыз.

End Эндотоксин Скавенгер супернатантка кушылганнан соң, супернатант турбидка әйләнәчәк, ләкинсупернатант боз мунчасында суытканнан соң ачык булырга тиеш (яки бераз турбидалы).

6. Супернатант бүлмә температурасында (> 25 ℃) 10-15 минутка урнаштырылганнан соң, ул турбид булып китәчәканың температурасы бүлмә температурасына кадәр күтәрелә.Аннары супернантны катнашырга кире кайтарырга кирәк.

Room Әгәр бүлмә температурасы түбән булса яки чыгару вакытын кыскартырга теләсәгез, супернатант 37 ~ 42 ℃ су мунчасында 5-10 минутка инкубацияләнергә мөмкин һәм чираттагы адым супернанттан соң ясалырга мөмкин.турбид була.

7. Фазаны аеру өчен, супернатантны якынча 11,000 әйләнештә (12,000 × г) 10 минут эчендә бүлмә температурасында (температура> 25 must булырга тиеш) центрифуга.Upperгары су фазасында ДНК бар, аскы зәңгәр майлы фаз катламында эндотоксин һәм башка пычраклар бар.КүчерүЯңа трубага ДНК булган су фазасы һәммайлы катламны ташлагыз.

Cent centентрифугация вакытында температура 25 than тан артык булырга тиеш, чөнки эффектив фаза аерылмыйтемпература бик түбән булса.

Δ Әгәр фазаны аеру эффектив булмаса, центрифугация температурасы 30 to һәм көйләнергә мөмкинцентрифугация вакыты 15 минутка кадәр арттырылырга мөмкин.

Blue Зәңгәр майлы катламны сорамагыз, чөнки анда эндотоксин һәм башка пычраклар бар.

Механизм

Реуспенсия Лизис Нейтральләштерү

7 7,5 мл буфер P1 өстәргә

7 7,5 мл буфер P2 өстәргә

7 7,5 мл буфер P4 өстәргә

Эндотоксинны чыгару

End Эндотоксин Скавенгерның гадәттән тыш күләменнән 1 тапкыр өстәргә

Бәйләү һәм юу

Is Изопропанол күләменең 0,5 тапкыр өстәргә

10 10 мл буфер PW өстәргә