PCR комплекты

Мәче No: HCR2020A

Antсемлек туры PCR комплекты үсемлек яфракларын, орлыкларны һ.б. көчәйтү өчен яраклы, һәм полисахаридлар һәм полифеноллар булмаган үсемлек үрнәкләрен югары үткәрү өчен кулланыла ала.ДНК полимеразының туры эволюциягә нигезләнгән үсемлекләрдәге PCR ингибиторларына өстен толерантлыгы бар.Шул ук вакытта ул 5 кб эчендә ДНК фрагментларын көчәйтү өчен яраклы югары көчәйтүчәнлекне саклый.Комплекттагы уникаль Лизис буферы яңа яки туңдырылган үсемлек тукымаларын ябыштыру өчен кулланылырга мөмкин.Эшләү җиңел һәм лизатны чистартмыйча көчәйтү шаблоны итеп кулланырга мөмкин.Системада саклагыч агентлар бар, алар чиста үрнәкләрне кат-кат туңдырганнан һәм эреткәннән соң эффектив көчәйтергә мөмкинлек бирә.2 Direct Завод туры мастер-микс көчәйтү реакциясен башкару өчен праймерлар һәм шаблоннар өстәргә тиеш, шуның белән торба үткәрү операцияләрен киметә һәм ачыклау үткәрү һәм нәтиҗәләрнең репродуктивлыгын яхшырта.

Компонентлар

* Directсемлек туры лизис буферы - өстәмә реагент, ул үрнәкләрне саклау вакытын озайту өчен үсемлек туры лизис буферы нейтральләштерү өчен кулланыла.Аны фактик ситуация буенча кулланырга мөмкин.

Саклау шартлары

2 Direct Завод туры мастер микс, -30 ~ -15 at саклагыз һәм кат-кат туңудан һәм эрүдән сакланыгыз;Directсемлек туры Лизис Буферы, -30 ~ -15 store яки 2 ~ 8 at саклагыз.

Эксперимент процессы

Ampleрнәк эшкәртү-Leafсемлек яфрагы

Туры ысул:Яшь яфракларны кулланырга киңәш ителә.Кечкенә һәм бердәм үрнәк алу өчен, диаметры 0,5 - 3 мм булган тишек тибү кулланыгыз, аннары үрнәкне турыдан-туры PCR системасына өстәгез (50 μл системасы тәкъдим ителә).Игътибар итегез, үрнәк PCR эремәсендә, труба стенасына түгел.Озын фрагментларны һәм катлаулы үрнәкләрне көчәйтү өчен туры PCR кулланылса, кечерәк диаметрлы (0,5 - 1 мм) үрнәкне шаблон итеп куллану яхшырак нәтиҗәләргә ирешергә ярдәм итә.

Тегермән лизис ысулы:Яшь яфракларны кулланырга киңәш ителә.Кечкенә яфрак кисәген алыгыз (диаметры якынча 1 - 3 мм), аны 20 μл туры Лизис Буфер Абына урнаштырыгыз һәм мөмкин кадәр тарттырыгыз (бу адым яфракны 100 μл пипетка белән кысып эшләп була. үрнәкне сөртергә).Яфрак тукымасының зуррак күләме кулланылса (7 ммнан артмагыз), эретү буферы күләмен 50 μлга кадәр арттырыгыз.Яфраклары җиргә төшкәч, эремә яшел булып күренергә тиеш.Кыска центрифугациядән соң, реакция системасына 1 μл супернатантны PCR системасына кушыгыз.

Rылылык лизис ысулы:Яшь яфракларны кулланырга киңәш ителә.Кечкенә яфрак кисәген алыгыз (диаметры якынча 1 - 3 мм), аны 20 μл Завод туры Лизис Буферына урнаштырыгыз, һәм 95 ° C 5-10 минутта җылытыгыз.Лизиз вакыты ябылу авыр булган яфраклар өчен тиешенчә озайтылырга мөмкин (20 минуттан артмаска).Яфрак тукымасының зуррак күләме кулланылса (7 ммнан артмагыз), эретү буферы күләмен 50 μлга кадәр арттырыгыз.Heatingылытканнан соң, центрифуга кыска, һәм реакция шаблоны буларак PCR системасына 1 μл супернатант кушыгыз.

Ampleрнәк эшкәртүAntПлант орлыгы

Тегермән лизис ысулы:Диаметры 5 мм булган орлыкларны кисәр өчен, скальпель кулланыгыз, аларны 100 μл үсемлек туры лизис буферы Ага кушыгыз, һәм үрнәкне пипетка очлары яки башка кораллар белән тарттырыгыз.Вортекс кыскача һәм бүлмә температурасында 3 - 5 минут торырга рөхсәт итегез.Орлык үрнәге эретү буферында су астында калганына инаныгыз.Кыска центрифугациядән соң, реакция шаблоны буларак PCR системасына 1 μл супернатант кушыгыз.

Rылылык лизис ысулы:Диаметры 5 мм булган орлыкларны кисәр өчен скальпель кулланыгыз, аларны 100 μл үсемлек туры лизис буферы Ага кушыгыз, һәм 95 ° C температурада 5-10 минутта җылытыгыз.Лизис вакыты ябу авыр булган яфраклар өчен тиешенчә озайтылырга мөмкин (30 минуттан артмый).Heatingылытканнан соң, центрифуга кыскача, реакция шаблоны буларак PCR системасына 1 μл супернатант кушыгыз.

а.Кайчы яки башка кораллар шулай ук ​​тиешле зурлыктагы үрнәкләрне кисәр өчен кулланылырга мөмкин;тимер яки кайчы кабат кулланылса, үрнәкләр арасындагы кисешүне булдырмас өчен, аларны 2% натрий гипохлорит эремәсе белән чистартырга кирәк.

б.Plantсемлекнең туры Лизис Буферы кулланылганчы тулысынча эреп беткәненә инаныгыз.Әгәр дә буфер ябык булса яки явым-төшем булса, аны кулланганчы аны тулысынча эретү өчен 37 at җылытырга мөмкин.

в.Реакция системасында шаблон күләме үсемлек материалы күләмендәге аермага карап һәм тиешенчә көйләнергә мөмкин.

Туры Лизис Буферы

Productсемлек туры Лизис Буферы Бу продукттагы күпчелек үсемлек тукымаларының геномын чыгару өчен катгый оптимальләштерелгән һәм чимал үсемлекләрен кыска вакытлы саклау өчен яраклы.Әгәр дә үрнәк озаграк сакланырга тиеш булса (мәсәлән, 1 - 2 ай), супернатантны яңа EP трубасына күчерергә һәм -20 at сакларга киңәш ителә.Samрнәкләрне тотрыклырак саклау өчен, күчерелгән супернатантка тигез күләмдә үсемлек туры лизис буферы кушыгыз, яхшылап кушыгыз һәм -20 at саклагыз.Тотрыклы саклау вакыты үсемлек үрнәкләре һәм шартлары белән үзгәрә.

Реакция системасы

а.Анда Mg бар²⁺соңгы концентрациядә 2 мм.

б.Eachәр праймер өчен соңгы концентрация 0,4μM кулланырга киңәш ителә.Праймерларны артык куллану билгеле булмаган көчәйтүгә китерәчәк.

в.Кулланылган үрнәк күләме фактик ситуация буенча көйләнергә мөмкин.Чиста лизланган үрнәкнең бер реакциясендә кулланылган күләм реакциянең гомуми күләменең 2% - 20% арасында көйләнергә мөмкин.Чиктән тыш күп үрнәкләр куллану көчәйтү уңышсызлыгына китерергә мөмкин.

Реакция программасы

а.Башлангыч денатурация (98 ℃, 5 мин) үсемлек тукымасының лизисын күтәрә, PCR көчәйтү өчен кулланыла ала торган геном ДНК чыгарып җибәрә.Вакытны кыскартмагыз, температураны киметмәгез.

б.Аны Tm праймерына тигез яки Tm кыйммәтеннән 2 ~ 4 ℃ югарырак куярга киңәш ителә.Бу продуктта кулланылган туры көчәйтү ДНК полимерасы гадәти Так ДНК полимеразыннан аерылып тора, һәм реакция анналь температурасына махсус таләпләр high югары анналь температураны куллану билгесез көчәйтүне эффектив киметергә һәм көчәйтү эффективлыгын күтәрергә мөмкин.Катлаулы шаблоннар өчен эффектив көчәйтү температурасын көйләү һәм озайту вакытын озайту белән ирешеп була.

в.Әгәр дә көчәйтү продуктының озынлыгы ≤1 кб булса, озайту вакыты 30 сек / кб итеп билгеләнә;көчәйтү продуктының озынлыгы> 1 кб булса, озайту вакыты 60 сек / кб итеп билгеләнә.

г.Аз көчәйтүчәнлеге булган катлаулы үрнәкләр яки үрнәкләр өчен цикллар саны тиешенчә 40 -50 циклга кадәр артырга мөмкин.

Кушымталар

Бу үсемлек тукымаларын турыдан-туры көчәйтү һәм полисахаридлар һәм полифеноллар булмаган үсемлек үрнәкләрен югары үткәрү өчен кулланыла.

Искәрмәләр

Тикшеренү өчен генә кулланыгыз.Диагностик процедураларда куллану өчен түгел.

1. Чиста үсемлекне көчәйтү яки туры көчәйтү өчен, система, праймериз һәм операцияләрнең дөреслеген тикшерү өчен эксперимент башланганчы чистартылган геном ДНКны уңай контроль итеп кулланырга киңәш ителә.

2. Бу комплектта кулланылган ДНК полимеразының туры көчәйтү көче көчле тикшерү эшчәнлегенә ия.Әгәр дә TA клонлаштырырга кирәк икән, аденин кушканчы ДНКны чистартырга киңәш ителә.

3. Праймериз дизайны ：

а.Праймерның 3 ′ очындагы соңгы база G яки C булырга тиеш.

б.Праймерның 3 ′ очында соңгы 8 базада эзлекле туры килмәүдән сакланырга кирәк.в.Праймерның 3 ′ очында чәч структураларыннан сакланыгыз.

г.Алга праймерның һәм кире праймерның Tm кыйммәтендәге аермалар 1 than дан артмаска тиеш, һәм Tm бәясе 60 ~ 72 to көйләнергә тиеш (Пример Премьер 5 Tm бәясен исәпләргә тәкъдим ителә).

д.Шаблон белән туры килмәгән өстәмә пример эзлеклелеге, праймер Tm бәясен исәпләгәндә кертелергә тиеш түгел.

f.Праймерның GC эчтәлеге 40% -60% булырга киңәш ителә.

g.Праймерда A, G, C һәм T гомуми бүленеше мөмкин кадәр булырга тиеш.GCгары GC яки AT эчтәлеге булган төбәкләрне кулланмагыз.

з.Праймер эчендә яки ике праймер арасында 5 яки аннан да күбрәк база тулыландыручы эзлеклелектән сакланыгыз һәм ике праймерның 3 ′ очында 3 яки аннан да күбрәк база тулыландыручы эзлеклелектән сакланыгыз.

i.Билгесез көчәйтүдән саклап калу өчен, праймерның үзенчәлеген тикшерү өчен NCBI BLAST функциясен кулланыгыз.