M-MLV Кире транскрипт
RevScript Кире транскриптаз генетик инженерия технологиясе белән алынган.Аның югары CDNA синтезлау сәләте, җылылык тотрыклылыгы һәм реакция температурасы чикләре бар (60 ° C кадәр).Синтезланган cDNA продукты 10 кб га кадәр.Ул шаблоннарның якынлыгын арттыра һәм катлаулы икенчел структурасы яки аз күчерелмә геннары булган РНК шаблоннарын кире транскрипцияләү өчен яраклы.
Компонентлар
| Компонент | HC2003Б (10,000U) | HC2003Б (5 * 10,000U) | HC2003Б (200,000U) |
| RevScript Кире Транскриптаз (200U / μL) | 50 μЛ | 5 × 50 μЛ | 1 мл |
| 5 × RevScript буферы | 250 μЛ | 1,25 мл | 5 мл |
Саклау торышы
Бу продукт 2 ел дәвамында -25 ° C ~ -15 ° C сакланырга тиеш.
Берәмлек төшенчәсе
Бер агрегат 1 нмол dTTPны кислотада эри торган материалга 10 минутта Олиго (dT) кулланып пример итеп куллана.
Реакция урнаштыру
1.РНК шаблонының денатурасы (Бу адым факультатив, РНК шаблонының денатурасы икенчел структураларны ачарга ярдәм итә, бу беренче полосаның cDNA уңышын яхшыртачак.)
| Компонентлар | Том (μL) |
| RNase бушлай ddH2O | 13кә |
| Олиго (dT)18 (50 μмол / Л) яки очраклы пример (50 μmol / L) Яисә Ген специфик примерлары (2 μмол / Л) | 1 |
| яки 1 | |
| яки 1 | |
| РНК шаблоны | X a |
Искәрмәләр:
1) а: Гомуми РНК: 1-5 уг яки mRNA: 1-500 нг
2) 5 минут эчендә 65 ° C инкубацияләү, аннары боз өстенә 2 минут суыту өчен күчү.Реакция сыеклыгын җыю, кире транскрипция реакция чишелешен өстәү өчен кыска центрифугация, түбәндәге таблицада күрсәтелгәнчә.Аралашу өчен йомшак пипетка.
1.Реакция катнашмасын әзерләү (20 μЛ күләм)
| Компонентлар | Том (μL) |
| Алдагы адым катнашмасы | 13 |
| 5 × Буфер | 4 |
| dNTP Микс (10нмол / Л) | 1 |
| Кире транскрипт (200 U / μL) | 1 |
| RNase ингибиторы (40 U / μL) | 1 |
1.Реакцияне түбәндәге шартларда башкар:
| Температура (° C) | Вакыт |
| 25 ° C.a | 5мин |
| 42 ° C.b | 15-30мин |
| 85 ° C.c | 5мин |
Искәрмәләр:
1) а.25 минутта 5 минутта инкубация очраклы гексамерлар куллану өчен генә кирәк.Зинһар, Олиго (dT) кулланганда бу адымны калдырыгыз18яки Ген специфик пример.
2) б.Тәкъдим ителгән кире транскрипция температурасы 42 ° C, катлаулы икенчел структуралар яки югары GC эчтәлеге булган шаблоннар өчен реакция температурасын 50-55 ° C ка күтәрергә киңәш ителә.
3) в.Кире транскриптазны активлаштыру өчен 5 минутта 85 ° C җылыту.
4) Продукция турыдан-туры PCR яки qPCR реакцияләрендә кулланылырга мөмкин, яки кыска вакытлы саклау өчен -20 ° C температурада сакланырга мөмкин.Продукцияне тигезләргә һәм озак вакыт саклау өчен -80 ° C температурада сакларга киңәш ителә.Еш кына туңудан сакланыгыз.
5) Продукция бер адымлы RT-qPCR өчен яраклы, һәр 25μL реакция системасы өчен 10-20 U кире транскриптаз өстәргә, яисә реаль ситуация буенча кире транскриптаз күләмен әкренләп арттырырга киңәш ителә.
Искәрмәләр
1.Зинһар, эксперимент мәйданын чиста тотыгыз;Эш вакытында чиста перчаткалар һәм битлекләр кияргә кирәк.Экспериментта кулланылган барлык куллану әйберләре RNase пычранмасын өчен RNase ирекле булырга тиеш.
2.РНК деградациясен булдырмас өчен барлык процедуралар боз өстендә башкарылырга тиеш.
3.Кире транскрипциянең югары эффективлыгын тәэмин итү өчен югары сыйфатлы РНК үрнәкләре тәкъдим ителә.
4.Бу продукт тикшерү өчен генә.
5.Зинһар, сезнең куркынычсызлыгыгыз өчен лаборатория пальто һәм бер тапкыр кулланыла торган перчаткалар белән эшләгез.
