M-MLV Neoscript Кире Транскриптаз
Neoscript Кире Транскриптаз - Молоней мурин лейкозы вирусының килеп чыгышы һәм E.coli'да чагылышы M-MLV генын мутацияләү ярдәмендә алынган кире транскриптаз.Фермент RNase H эшчәнлеген бетерә, температураның чыдамлылыгы югары, һәм югары температураның кире транскрипциясе өчен яраклы.Шуңа күрә, РНКның югары дәрәҗәдәге структурасының һәм специфик булмаган факторларның CDNA синтезына уңайсыз тәэсирен бетерү өчен файдалы, һәм тотрыклылыгы һәм кире транскрипция синтезы мөмкинлеге бар.Фермент тотрыклылыгы һәм кире транскрипция синтезы сәләтенә ия.
Компонентлар
1.200 U / μL Neoscript Кире Транскриптаз
2.5 × Беренче катлы буфер (өстәмә)
* 5 × Беренче катлы буферда dNTP юк, реакция системасын әзерләгәндә dNTP-ны өстәгез
Тәкъдим ителгән гариза
1.Бер адымлы qRT-PCR.
2.РНК вирусын ачыклау.
Саклау торышы
Озак вакыт саклау өчен -20 ° C, кулланганчы яхшылап кушылырга, еш туңудан сакланырга кирәк.
Берәмлек төшенчәсе
Бер агрегат 1 нмол dTTPны 10 минутта 37 ° C поли (A) • олиго (dT) куллана.25шаблон / праймер буларак.
Сыйфат белән идарә итү
1.SDS-PAGE электрофоретик чисталыгы 98% тан артык.
2.Көчәйтү сизгерлеге, партиядән партиягә контроль, тотрыклылык.
3.Экзоген нуклеаз эшчәнлеге юк, экзоген эндонуклаз яки экзонуклаз пычрануы юк
Беренче чылбыр реакциясен чишү өчен реакция урнаштыру
1.Реакция катнашмасын әзерләү
| Компонентлар | Том |
| Олиго (dT)12-18 Праймер яки очраклы примера Яисә Ген специфик примерларыb | 50 сәгать |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 сәгать | |
| 10 мм dNTP | 1 μЛ |
| Шаблон РНК | Барлыгы RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μг |
| RNase-dH2O | 10 μЛга |
Искәрмәләр:а / б: Зинһар, эксперимент ихтыяҗларыгызга карап төрле төр праймерларны сайлагыз.
2.65 минутта 5 минутта җылытырга һәм бозда 2 минутка тиз салкын.
3.Aboveгарыдагы системага 20µL күләменә түбәндәге компонентларны өстәгез һәм йомшак кына кушыгыз:
| Компонентлар | Том (μL) |
| 5 × Беренче катлы буфер | 4 |
| Neoscript Кире Транскриптаз (200 U / μL) | 1 |
| RNase ингибиторы (40 U / μL) | 1 |
| RNase-dH2O | 20 μЛга кадәр |
4. Зинһар, реакцияне түбәндәге шартлар буенча башкарыгыз:
(1) Әгәр очраклы пример кулланылса, реакция 25 in 10 минутта, аннары 50 30 30 ~ 60минс өчен башкарылырга тиеш;
(2) Әгәр Oligo dT яки махсус праймериз кулланылса, реакция 50 at 30 ~ 60минга кадәр башкарылырга тиеш.
5.Neoscript Кире Транскриптазны активсыз калдыру һәм реакцияне туктату өчен 5 минутта 95 at җылыт.
6.Кире транскрипция продуктлары турыдан-туры PCR реакциясендә һәм флуоресцент санлы PCR реакциясендә кулланылырга мөмкин, яки -20 at озак сакланырга мөмкин.
PCR R.реакция ：
1.Реакция катнашмасын әзерләү
| Компонентлар | Концентрация |
| 10 × PCR буферы (dNTP бушлай, Mg² + бушлай) | 1 × |
| dNTPs (һәр dNTP 10мМ) | 200 μM |
| 25 мм MgCl2 | 1-4 мм |
| Так ДНК полимерасы (5U / μL) | 2-2.5 U. |
| Праймер 1 (10 μМ) | 0,2-1 ММ |
| Праймер 2 (10 μМ) | 0,2-1 ММ |
| Шаблона | ≤10% Беренче чылбыр реакциясе чишелеше (2 μЛ) |
| ddH2O | 50 μЛ |
Искәрмәләр:а: Әгәр беренче чылбыр реакциясе чишелеше бик күп булса, PCR реакциясе тыелырга мөмкин.
2.PCR реакция процедурасы
| Адым | Температура | Вакыт | Cyикллар |
| Алдан денатурация | 95 ℃ | 2-5 минут | 1 |
| Денатурация | 95 ℃ | 10-20 сек | 30-40 |
| Аннальинг | 50-60 ℃ | 10-30 сек | |
| Киңәйтү | 72 ℃ | 10-60 сек |
Искәрмәләр
1.42 ℃ ~ 55 range диапазонында кире транскрипция температурасын оптимизацияләү өчен яраклы.
2.Аның яхшырак тотрыклылыгы бар, югары температураның кире транскрипция көчәйтү өчен яраклы.Моннан тыш, РНКның катлаулы структур регионнары аша эффектив узу өчен уңайлы.Шулай укбер этаплы мультиплекс флуоресцент санлы RT-PCR ачыклау өчен яраклы.
3.Төрле PCR көчәйтү ферментлары белән яхшы ярашу һәм югары сизгерлек RT-PCR реакцияләре өчен яраклы.
4.Highгары сизгерлек өчен яраклы бер этаплы флуоресцент санлы RT-PCR реакциясе, шаблоннарның түбән концентрациясен ачыклау тизлеген яхшырта.
5.CDNA китапханә төзелеше өчен яраклы.
