Вакциния вирусы тоту ферменты

Вакциния вирусы каплау ферменты рекомбинант Э. coli штаммыннан алынган, Вакциния каплау ферменты өчен геннар йөртә.Бу бер фермент ике субуниттан (D1 һәм D12) тора һәм өч энзиматик эшчәнлеккә ия (РНК трифосфатазы һәм D1 субуниты тарафыннан гуанилтрансфераза һәм D12 субуниты гуан метилтрансферасы).Вакциния вирусы Каплау ферменты капка структурасын формалаштыру өчен эффектив, ул 7-метилгуанилат капка структурасын (m7Gppp, Cap 0) РНКның 5 ′ очына бәйли ала.Капка структурасы (капка 0) mRNA тотрыклыландыруда, эукариотларда транспортта һәм тәрҗемә итүдә мөһим роль уйный.Энзиматик реакция белән РНКны тоту - эффектив һәм гади ысул, ул витро транскрипция, трансфекция һәм микроинжекция өчен РНКның тотрыклылыгын һәм тәрҗемәсен сизелерлек яхшырта ала.

Компонентлар

Вакциния вирусы каплау ферменты (10 U / μL)

10 × Буферны каплау

Саклау шартлары

Саклау өчен -25 ～ - 15 repeated кат-кат туңдыру циклыннан сакланыгыз）

Саклау буферы

20 мм Tris-HCl (pH 8.0), 100 мм NaCl,

1мМ ДТТ, 0. 1ММ ЭДТА, 0. 1% Тритон X- 100, 50% глицерол.

Берәмлек төшенчәсе

Вакциния вирусының бер берәмлеге Каплау ферменты 10 градус ГТПны 80нт транскрипциягә кертү өчен кирәк булган фермент күләме дип билгеләнә, 1 сәгать эчендә 37 ° C.

Сыйфат белән идарә итү

Exonuclease:Вакциния вирусы 10У 1μg λ-Hind III белән ДНКны 37 digest ашатучы 16 сәгать эчендә агароза гели электрофорезы белән билгеләнгән деградация китерми.

Эндонуклез:Вакциния вирусы 10У 1μг λDNA белән 37 at 16 сәгать эчендә 16 сәгать дәвамында агароза гели электрофорезы белән билгеләнгән деградация китерми.

Никаз:Вакциния вирусы 10U 1 μg pBR322 белән 37 at белән 16 сәгать эчендә 16 сәгать дәвамында агароза гели электрофорезы белән билгеләнгән деградация китерми.

RNase:Вакциния вирусы 10U 1,6μg MS2 RNA белән каплау ферменты 37 сәгатьтә 4 сәгать дәвамында агароза гели электрофорезы белән билгеләнгән деградация китерми.

1.coli DNA:10U вакциния вирусы Каплау ферменты E. coli 16S rRNA локусы өчен махсус праймериз белән TaqMan qPCR ярдәмендә E. coli геномик ДНК булуы өчен тикшерелә.E. coli геном ДНК пычрануы ≤1 E. coli геномы.

2.Бактерия Эндотоксин: LAL-тест, Кытай фармакопоя IV 2020 басмасы буенча, гель лимитын сынау ысулы, гомуми кагыйдә (1143).Бактерияле эндотоксин күләме EU10 ЕС / мг булырга тиеш.

Реакция системасы һәм шартлары

1. Протоколны каплау (реакция күләме: 20 μЛ)

Бу процедура 10μг РНК (≥100 нт) каплау реакциясенә кагыла һәм ул эксперимент таләпләре буенча киңәйтелергә мөмкин.

I) 10μг РНК һәм Нуклеизсыз H2Oны 1,5 мл микрофуга торбасында берләштерегез, соңгы күләмгә 15,0 µЛ.* 10 × Каплау буферы: 0,5М Tris-HCl, 50 мм KCl, 10 мм MgCl2, 10 мм DTT, (25 ℃, pH 8.0)

2) 65 atта 5 минутта җылытырга, аннары боз мунчасына 5 минут.

3) Күрсәтелгән тәртиптә түбәндәге компонентларны өстәгез

* 10 × Буферны каплау ： 0,5 М Tris-HCl, 50 мм KCl, 10 мм MgCl2, 10 мм DTT, (25 ℃, pH8.0)

4) 30 минут эчендә 37 ° C инкубацияләгез, РНК хәзер капланган һәм түбән агымдагы кушымталарга әзер.

2. 5 ′ терминал маркировкалау реакциясе (реакция күләме: 20 μL)

Бу протокол 5´ трифосфат булган РНКны маркировкалау өчен эшләнгән һәм ул таләпләр буенча масштабланырга мөмкин.Ярлыкны кертү эффективлыгы РНКның моляр катнашлыгына тәэсир итәчәк: GTP, шулай ук ​​РНК үрнәкләрендәге GTP эчтәлеге.

1) 1,5 мл микрофуга торбасында тиешле күләмдә РНК һәм Нуклеизсыз H2Oны берләштерегез, соңгы күләмгә 14,0 µЛ.

2) 65 atта 5 минутта җылытырга, аннары боз мунчасына 5 минут.

3) Күрсәтелгән тәртиптә түбәндәге компонентларны өстәгез.

** GTP MIX GTP һәм аз санлы маркерларны аңлата.GTP концентрациясе өчен карагыз3.

4) 37 минутта 30 минутка инкубацияләгез, РНК 5 ′ ахыры маркировкаланган һәм түбән агымга әзер

Кушымталар

1. Тәрҗемә анализларына кадәр / mRNA тәрҗемә итү

2. mRNAның 5´ очын маркировкалау

Куллану турында искәрмәләр

1.Вакциния каплау ферменты белән инкубациягә кадәр РНК эремәсен җылыту транскрипциянең 5´ендында икенчел структураны бетерә.Билгеле югары структуралы 5´ends белән транскрипцияләр өчен вакытны 60 минутка озайтыгыз.

2. Реакцияләрне каплау өчен кулланылган РНК нуклеузсыз суда кулланылганчы чистартылырга тиеш.EDTA булырга тиеш түгел һәм чишелеш тозсыз булырга тиеш.

3. 5´ очын маркировкалау өчен, гомуми GTP концентрациясе реакциядә mRNA концентрациясенең 1-3 тапкырга якын булырга тиеш.

4. Реакция системасының күләме фактка карап киңәйтелергә яки түбәнәйтелергә мөмкин.