PNGase F.
Пептид-Н-Гликозидаз F (PNGase F) - гликопротеиннардан барлык N-бәйләнгән олигосакаридларны диярлек чыгару өчен иң эффектив энзиматик ысул.PNGase F - амидаз, ул иң күп GlcNAc һәм югары манноз, гибрид һәм N бәйләнгән гликопротейннардан катлаулы олигосакаридларның аспарагин калдыклары арасында ярыла.
Кушымта
Бу фермент углевод калдыкларын протеиннардан чыгару өчен файдалы.
Әзерлек һәм спецификация
Күренеш | Төссез сыеклык |
Протеин чисталыгы | ≥95% (SDS-PAGE дан) |
Эшчәнлек | 00500,000 U / мл |
Экзогликозида | Бернинди дә активлык табылмады (ND) |
Эндогликозида Ф1 | ND |
Эндогликозида F2 | ND |
Эндогликозида F3 | ND |
Эндогликозида Х. | ND |
Протеаз | ND |
Сыйфатлар
EC саны | 3.5.1.52(Микроорганизмнан рекомбинант) |
Молекуляр авырлык | 35 kDa (SDS-PAGE) |
Изоэлектрик нокта | 8. 14 |
Оптималь рН | 7.0-8.0 |
Оптималь температура | 65 ° C. |
Субстрат үзенчәлек | GlcNAc һәм аспарагин калдыклары арасында гликозидик бәйләнешләрне чистарту |
Танып белү сайтлары | N1-3 фукоза булмаса, N-бәйләнгән гликаннар 2 нче рәсем |
Активаторлар | DTT |
Ингибитор | SDS |
Саклау температурасы | -25 ~ -15 ℃ |
Atылылык инакивациясе | 1µL PNGase F булган 20µL реакция катнашмасы 75 минутта 10 минут эчендә инкубация белән активсыз. |
PNGase F субстрат үзенчәлеге
2 нче рәсем PNGase F тану урыннары.
Эчке GlcNAc калдыклары α1-3 фукоза белән бәйләнгәндә, PNGase F гликопротеиннардан N бәйләнгән олигосакаридларны аера алмый.Бу модификация үсемлекләрдә һәм кайбер бөҗәкләр гликопротеиннарында еш очрый.
Cкомпонентлар
| Компонентлар | Концентрация |
1 | PNGase F. | 50 µл |
2 | 10 × Гликопротеин Денатуринг Буферы | 1000 µл |
3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µл |
4 | 10% NP-40 | 1000 µл |
Берәмлекне билгеләү
Бер берәмлек (U) углеводның 95% 10 µг денатурланган RNase B-тан чыгару өчен кирәк булган фермент күләме дип билгеләнә, гомуми реакция күләмендә 10 µL.
Реакция шартлары
1. 1-20 µг гликопротеинны деонизацияләнгән су белән эрегез, 10 µл гомуми реакция күләмен ясар өчен 1 µл 10 × Гликопротеин Денатурлау Буферы һәм H2O кушыгыз (кирәк булса).
2.100 минутта 10 минутка инкубацияләгез, бозда суытыгыз.
3.2 µl 10 × GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 кушыгыз һәм кушыгыз.
4.1-2 µl PNGase F һәм H өстәргә2О (кирәк булса) 20 µл гомуми реакция күләмен ясарга һәм кушарга.
5.37 минутта инкубация реакциясе 60 минут.
6.SDS-PAGE анализы яки HPLC анализы өчен.