mRNA Cap2'-O-Метилтрансфераз

mRNA Cap 2´ -O-метилтрансфераз рекомбинант Э. coli штаммыннан алынган, mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase вакцинасы өчен ген йөртә.Бу фермент РНКның 5´endендә капка структурасына янәшә торган беренче нуклеотидның 2´-O позициясендә метил төркемен өсти. Фермент S-adenosylmethionine (SAM) метил доноры буларак метилат белән капланган РНК (капка) куллана. -0) нәтиҗәдә капка-1 структурасы.

Cap1 структурасы тәрҗемә эффективлыгын арттыра, трансфекциядә һәм микроинжекция экспериментларында mRNA экспрессиясен яхшырта ала. Бу фермент субстрат буларак m7GpppN капкасы булган РНКны таләп итә.5´ ахырында pN, ppN, pppN яки GpppN белән РНКны куллана алмый.Капланган РНК витро транскрипция ярдәмендә кап аналогын кулланып яки Вакциния Каплау Ферментын кулланып энзиматик каплау аша әзерләнергә мөмкин.

Компонентлар

mRNA Кап 2´-О-Метилтрансфераз (50U / μL)

10 × Каплау реакциясе буферы

Саклау

Саклау өчен -25 ～ - 15 repeated кат-кат туңдыру циклыннан сакланыгыз）

Саклау буферы

20 мм Tris-HCl （pH 8.0，25 ℃), 100 мм NaCl, 1 мм DTT, 0. 1 мм EDTA, 0. 1% Тритон X- 100 ， 50% глицерол.

Берәмлекне билгеләү

Бер агрегат метилат өчен кирәк булган фермент күләме дип билгеләнә, 10 плом 80 РНК транскрипциясен 1 сәгать эчендә 37 ° C.

Сыйфат белән идарә итү

Экзонуклаз.

Эндонуклаз: 50 U mRNA капка 2 ´ -О-Метилтрансфераз 1 μг λDNA белән 37 at 16 сәгать эчендә 16 сәгать дәвамында агароза гели электрофорезы белән билгеләнгән деградация китерми.

Никаз.

RNase.

E. coli ДНК: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase барлыгы өчен тикшереләE. coli Геном ДНК TaqMan qPCR кулланып махсусE. coli 16S rRNA бүлеге..Әр сүзнеңE. coli геном ДНК пычрануы = 1E. coli геном.

Бактерия Эндотоксин: LAL-тест, Кытай фармакопоя IV 2020 басмасы буенча, гель лимитын сынау ысулы, гомуми кагыйдә (1143).Бактерияле эндотоксин күләме = 10 ЕС / мг булырга тиеш.

Реакция системасы һәм шартлары

1. 1,5 мл микрофуга трубасында тиешле күләмдә капланган РНК һәм RNase-H2Oны берләштерегез, соңгы күләмгә 16,0 µЛ.

2. 65 at 5 минутта җылытырга, аннары 5 минутка боз мунчасы.

3. Күрсәтелгән тәртиптә түбәндәге компонентларны өстәгез (Капланган РНКны метилизацияләү өчен)

10дан ким

* 10 × Каплау реакциясе буферы: 500 мм Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 мм KCl, 10 мм MgCl2 、 10 мм DTT.

4. 37 at 1 сәгать эчендә инкубацияләгез (200 нттан да ким булмаган максат фрагменты өчен 2 сәгать инкубация тәкъдим ителә).

Кушымталар

Микроинжекция һәм трансфекция экспериментлары вакытында mRNA экспрессиясен яхшырту.

Куллану турында искәрмәләр

1. Реакциягә кадәр РНКны чистартырга һәм нуклеузсыз суда эретергә кирәк, барлык чишелешләрдә бернинди EDTA һәм ион булырга тиеш түгел.

2. РНК үрнәген транскрипциянең 5´ендында икенчел структураны бетерү өчен реакция алдыннан 5 минутта 65 минутта җылытырга киңәш ителә.Комплекслы 5 ter-терминал структурасы өчен 10 минутка озайтылырга мөмкин.