Ике катлы РНК (dsRNA) ЭЛИСА КИТ

Бу комплект фермент белән бәйләнгән иммуносорбент анализы (ELISA), биотин-Стрептавидин системасы белән кушылган, эзлеклелегенә карамастан, озынлыгы 60 төп пардан (бп) озынлыктагы dsRNA-ны санлы үлчәү өчен.Тәлинкә анти-dsRNA антителасы белән капланган.ampleрнәктә булган dsRNA кушыла һәм кое белән капланган антителаларга бәйләнә.Аннары биотинилатланган анти-dsRNA антителасы кушыла һәм үрнәктә dsRNA белән бәйләнә.Hingынганнан соң, HRP-Стрептавидин кушыла һәм биотинилатланган анти-dsRNA антителасына бәйләнә.Инкубациядән соң HRP-Стрептавидин юыла.Аннары TMB субстрат эремәсе HRP тарафыннан кушыла һәм катализацияләнә, зәңгәр төсле продукт җитештерә, кислоталы тукталыш эремәсе кушылганнан соң сары төскә керә.Сары тыгызлык тәлинкәдә алынган dsRNA максатчан күләменә пропорциональ.Сүндерү 450 нм белән үлчәнә.

Кушымта

Бу комплект dsRNA калдыкларын санлы үлчәү өчен.

Комплект компонентлары

Саклау һәм тотрыклылык

1. Кулланылмаган комплект өчен: бөтен комплектны саклану срогында 2 ~ 8 at сакларга мөмкин.Саклау тотрыклылыгы өчен көчле яктылыктан сакланырга кирәк.

2. Кулланылган комплект өчен: Микроплит ачылганнан соң, зинһар, кулланылмаган скважиналарны тәлинкә мөһере белән каплагыз һәм десиктант пакеты булган фольга сумкасына кире кайтыгыз, фольга сумкасын мөһерләгез һәм кулланганнан соң тиз арада 2 ~ 8 to кире кайтыгыз.Башка реагентлар кулланганнан соң тизрәк 2 ~ 8 to кайтарылырга тиеш.

Материаллар кирәк, ләкин тәэмин ителми

1. 450 ± 10нм фильтрлы микроплит укучы (450 һәм 650 нм дулкын озынлыгын ачыклый алсаң яхшырак).

2. Микроплит салгыч.

3. RNaseсыз киңәшләр һәм центрифуга торбалары.

Флохарт операциясе

Сез башлар алдыннан

1. Барлык комплект компонентларын һәм үрнәкләрен бүлмә температурасына китерегез (18-25 ℃).Әгәр комплект берьюлы кулланылмаса, зинһар, хәзерге эксперимент өчен полосалар һәм реагентлар гына алыгыз, калган полосаларны һәм реагентларны кирәкле шартларда калдырыгыз.

2. Буферны юыгыз: 40мл 20 × концентрат юу буферын 760мл деонизацияләнгән яки дистилляцияләнгән су белән эретегез, 800мл 1 × юу буферы әзерләгез.

3. Стандарт: куллану алдыннан запас чишелешен кыскача әйләндерегез яки центрифуга.Бирелгән дүрт стандартның концентрациясе 5ng / μL.UTP һәм pUTP dsRNA стандартлары өчен запас чишелешне 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg / μL стандарт сызыкны сызу өчен STE буферы белән эретегез.N1-Me-pUTP dsRNA стандартлары өчен, запас чишелешен 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg / μL стандарт сызыкны сызу өчен STE буферы белән эретегез.5-OMe-UTP dsRNA стандарты өчен, запас чишелешен 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg / μL стандарт сызык сызу өчен STE буферы белән эретегез.Стандартларны түбәндәге схемалар кебек эретергә киңәш итәбез:

4. Биотинилатлаштырылган антитела һәм HRP-стрептавидин эш эремәсе: куллану алдыннан запас эремәсен кыскача әйләндерү яки центрифуга.Аларны эш концентрациясенә эретү буферы белән эретегез.

5. ТМБ субстаты: стерилизацияләнгән киңәшләр белән эремәнең кирәкле дозасын эзләгез һәм калдык эремәсен касәгә ташламагыз.ТМБ субстаты яктылыкка сизгер, ТМБ субстратын озак вакыт яктыртмагыз.

Протокол куллану

1. Консерв өчен кирәкле полосалар санын билгеләгез.Куллану өчен рамнарга полосалар кертегез.Бу анализда кулланылмаган калган тәлинкә полосаларын капчыкка десиктант белән кайтарырга кирәк.Суыткыч саклау өчен сумканы тыгыз ябыгыз.

2. Тиешле скважиналарга стандарт, буш һәм үрнәкләрнең һәрберсен 100μL кушыгыз.Тәлинкә мөһере белән каплагыз.Бүлмә температурасында 1 сәгать инкубацияләгез, 500 сәгатьтә селкенеп.Төгәл анализ өчен тиешле концентрациягә үрнәкләр STE буферы белән эретелергә тиеш.

3. Адымны юыгыз: Чишелешкә омтылыгыз һәм һәр коега 250μL юу буферы белән юыгыз һәм 30-нчы ел торырга рөхсәт итегез.Тәлинкәне сеңдергеч кәгазьгә сугып, юу буферын тулысынча ташлагыз.4 тапкыр тулысынча юыгыз.

4. wellәр скважинага 100μL биотинилатланган антитела эш эремәсе кушыгыз.Тәлинкә мөһере белән каплагыз.Бүлмә температурасында 1 сәгать инкубацияләгез, 500 сәгатьтә селкенеп.

5. washу адымын кабатлагыз.

6. wellәр скважинага 100μL HRP-стрептавидин эш эремәсе кушыгыз.Тәлинкә мөһере белән каплагыз.Бүлмә температурасында 30 минутка инкубацияләгез, 500рм.

7. washу адымын кабатлагыз.

8. wellәр скважинага 100μL ТМБ субстрат эремәсе кушыгыз.Тәлинкә мөһере белән каплагыз.ТРда 30 минут инкубацияләгез Яктылыктан саклагыз.Сыеклык субстрат эремәсе кушылып зәңгәр төскә керәчәк.

9. wellәр скважинага 50μL тукталыш эремәсе кушыгыз.Сыеклык тукталыш эремәсе кушып сары төскә керәчәк.Аннары микроплит укучыны эшләгез һәм шунда ук 450нм үлчәү үткәрегез.

Нәтиҗәне исәпләү

1. standardәрбер стандарт, контроль, үрнәкләр өчен икеләтә укуны уртача алыгыз һәм оптик тыгызлыкның уртача нульсен алыгыз.Вертикаль (Y) күчәрендә һәм горизонталь (X） күчәрендә dsRNA концентрациясе) белән стандарт сызык төзегез.

2. Хисапны 5 яки 4 параметрлы сызыклы булмаган модельдә компьютер нигезендә кәкре җайланма программалары белән эшләргә киңәш ителә, мәсәлән, кәкре эксперт 1.3 яки ELISA Calc.

Спектакль

1. Сәнгатьчәнлек:

ачыклауның түбән чиге: ≤ 0,001pg / μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA өчен), ≤ 0.01pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA өчен).

санның түбән чиге: 0.0156 pg / μL (UTP-, pUTP-dsRNA өчен), 0.0312 pg / μL (N1-Me-pUTP-dsRNA өчен), 0.0625 pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA өчен).

2. Төгәллек: Эчке анализ резюме ≤10%, Ассайара резюме ≤10%

3. Бетерү: 80% ~ 120%

4.Линарит: 0.0156-0.5pg / μL (forUTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg / μL (forN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA өчен).

Уйланулар

1. ТМБ реакция температурасы һәм вакыты бик мөһим, зинһар, аларны инструкция буенча контрольдә тотыгыз.

2. Яхшы анализ ясау һәм сизгерлеккә ирешү өчен, реакцияләнмәгән артык реагентларны бетерү өчен тәлинкәләрне дөрес юу мөһим.

3. Барлык реагентларны кулланганчы яхшылап катнашырга һәм үрнәк яки реагентлар өстәү вакытында ватылудан сакланырга кирәк.

4. Әгәр концентрацияләнгән юу буферында (20х) кристалллар барлыкка килгән булса, 37 warm кадәр җылы булыгыз һәм кристалллар тулысынча эреп беткәнче йомшак катнашыгыз.

5. Натрий Азид (NaN3) булган үрнәкләрне тикшерүдән сакланыгыз, чөнки ул dsRNA күләмен бәяләмәгән HRP эшчәнлеген юкка чыгарырга мөмкин.

6. Анализ вакытында RNase пычрануыннан сакланыгыз.

7. Стандарт / үрнәк, ачыклау антителасы һәм SA-HRP шулай ук ​​ТРда калтыранмыйча үткәрелергә мөмкин, ләкин бу ачыклау сизгерлеген бер тапкыр киметергә мөмкин.Бу очракта без UTP һәм pUTP dsRNA стандартларын 2pg / μL дан эретергә киңәш итәбез, N1-Me-pUTP dsRNA стандартлары 4pg / μL һәм 5-OMe-UTP dsRNA стандарты 8pg / μL дан эретелергә тиеш.Моннан тыш, HRP-стрептавидин эш эремәсен бүлмә температурасында 60 минутка инкубацияләгез.Фласс салгычны кулланмагыз, чөнки фласс салгыч дөрес булмаган нәтиҗәләргә китерергә мөмкин.

Типик нәтиҗә

1. Стандарт сызык мәгълүматлары

2. Стандарт сызыкны исәпләү

3. Лайнерны ачыклау диапазоны: 0.0312- 1pg / μL